Mass histology of Drosophila heads (Heisenberg-Böhl-Method)

Construction plan for fly collar

Look at some examples of paraffin embedded headsections

Literature:

Heisenberg M, Böhl K (1979) Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Z. Naturforsch. 34: 143-147

Jäger R. and Fischbach K.-F. (1987): Some improvements of the Heisenberg-Böhl Method for Mass Histology of Drosophila heads. DIS 66, 162-165.


Protokoll Kragentechnik

Die Kragenmethode wird verwendet, um bis zu 20 Köpfe gleichzeitig in Frontal-, Horizontal- oder Sagittal-Serienschnitten zu schneiden (Heisenberg und Böhl, 1979; Jäger und Fischbach, 1987). Die Kragenmethode ermöglicht Massenhistologie mit direktem Vergleich verschiedener Phänotypen. Kragen werden auch verwendet für Kryoserienschnitte von mehreren Köpfen (Fischbach und Technau, 1984), und um betäubte Fliegen während der Präparation des Gehirns festzuhalten.

1. Die mit Ether betäubten Fliegen werden mit einer Dumont-Pinzette am Flügelansatz gefasst und am Hals in den Metallschlitz des Kragens eingeführt.

Mit einer Pinzette oder einem feinen Stahldraht die Fliege verschieben, bis die gewünschte Position und Orientierung im Kragen erreicht ist.

2. Weissäugige Tiere werden als Marker zwischen verschiedenen Phänotypen mit aufgezogen. Wenn weissäugige Tiere allein untersucht werden, dann sollten rotäugige Tiere mit aufgefädelt werden. Der wildtypische Augenfarbstoff wird für die Autofluoreszenz des Gewebes benötigt.

3. Kragenprotokoll mit folgenden Angaben anfertigen: Nummer des Kragens, Fixierungsdatum, Stamm, Kreuzung, Anordnung der Tiere und Markertiere. Die auf den Kragen aufgezogenen Fliegen werden in Paraffin eingebettet oder mit dem Kryotom geschnitten.

Fixierung und Einbettung der Fliegen

Lösungen:

Carnoy-Fixier-Lsg; 100% getrockneter EtOH; Methylbenzoat; Paraffin; Histowachs.

Durchführung:

1. Tag:

1. 4 h Fixation der Fliegen auf Kragen in Carnoy-Fixier-Lsg.

2. 40 min Trocknen der Präparate in technischem EtOH.

3. 2 x 40 min Trocknen der Präparate in 100% getrocknetem EtOH.

4. Ueber Nacht: Inkubation der Präparate in Methylbenzoat.

2. Tag:

5. 90 min Inkubation bei 65¡C in 50 % (v/v) Paraffin in Methylbenzoat.

6. 4 x 1 h Inkubation bei 65¡C in jeweils frischem Paraffin.

7. Kragen mit den Köpfen nach oben in Gussformen aus Alufolie legen (frontale Orientierung) oder längskant ausrichten (horizontale Orientierung) und sofort mit flüssigem Paraffin überschichten.

Schneiden der in Paraffin eingebetteten Fliegen

1. In das erstarrte Paraffin wird ein erhitzter und numerierter Metallblock eingeschmolzen. Die Nummer des Metallblocks in das Kragenprotokoll eintragen.

2. Gussform entfernen. Kragen mit Rasierklinge freilegen und vorsichtig abtrennen, so dass die Köpfe im Paraffinblock verbleiben.

3. Mit einer Rasierklinge den Paraffinblock auf Dachform zutrimmen.

4. Paraffinblock mit dem Metallblock in Objekthalter des Schlittenmikrotoms so einspannen, dass die Kopfreihe parallel zur Messerschneide liegt.

5. Schnitte von 7 mm Dicke anfertigen. Die Serienschnitte werden mit Pinseln auf wasserbeschichtete Objektträger übertragen.

6. Objektträger mit Schnitten bei 40¡C auf Wärmeplatte eintrocknen. Die Schnitte richten sich beim Trocknen aus und die Augenfarbstoffe gelangen durch Diffusion ins Gewebe.

7. 2-4 h Inkubation in Xylol, um Paraffin zu entfernen. Objektträger im Abzug trocknen. Einbetten in DePeX.

8. Auswertung der Objektträger im Auflichtfluoreszenzmikroskop. Der diffundierte Augenfarbstoff bewirkt eine Fluoreszenzfärbung, die gelblich in den Cortices und grünlich in den Neuropilen ist.

Neuerdings haben wir die Schnitte auch im Konfokalen Mikroskop betrachtet. Dies liefert reizvolle Falschfarbenbilder mit besonders vielen Details (Beispiele)


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